Sichelzellen-verursachende Mutation mit effizienter CRISPR-Cas9-Genom-Editierung korrigieren

Die Genombearbeitung unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems hat eine enorme Aussicht auf eine therapeutische Korrektur von genetischen Fehlern in menschlichen Zellen. Vor der Einführung als medizinisches Therapeutikum müssen Sicherheitsbedenken in Bezug auf Off-Target-Effekte minimiert werden, um Risiken zu minimieren, die aus der unbeabsichtigten Wirkung dieses Systems an ähnlichen, aber nicht identischen Stellen mit dem gewünschten Zielort des Gens resultieren können. In einer heute in Nature Medicine veröffentlichten Studie beschreiben Forscher der Integrated DNA Technologies (IDT) und des Labors von Prof. Matthew Porteus von der Stanford University eine neuartige Cas9-Mutante, die eine höhere Spezifität aufweist und eine hohe Aktivität beim medizinisch relevanten Ribonukleoprotein (RNP) beibehält ) Format. Das Potential für die medizinische Verwendung des neuen mutierten Enzyms wurde in menschlichen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) nachgewiesen, wo es in der Lage war, die Mutation in dem für die Sichelzellenkrankheit (SCD) verantwortlichen beta-Hämoglobin-Gen zu korrigieren. Mehrere Gruppen beschrieben zuvor Cas9-Mutanten mit verbesserter Spezifität; Alle zeigen jedoch signifikant verringerte Aktivität, wenn sie im klinisch relevanten RNP-Format verwendet werden. Diese früheren Mutanten wurden unter Verwendung eines intelligenten Designs basierend auf bekannten Proteinkristallstrukturen entwickelt. Stattdessen verwendeten IDT-Wissenschaftler eine unvoreingenommene Methode, um etwa 250.000 zufällige Cas9-Mutanten zu untersuchen, um jene seltenen Mutanten zu identifizieren, die die Spezifität verbesserten, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen. Nach mehreren Selektionsrunden entstand eine einzelne Mutante, die nun als Alt-R HiFi Cas9-Nuclease bekannt ist und die gewünschten hohen Ziel-zu-niedrig-Ziel-Eigenschaften bereitstellt. In der veröffentlichten Studie demonstriert ein kollaboratives Team von IDT und Stanford das robuste On-Target-Editing und die minimale Off-Target-Spaltung, die HiFi Cas9 an mehreren therapeutisch relevanten Loci in schwer zu bearbeitenden HSPCs erreicht. Sie zeigen auch eine HiFi-Cas9-vermittelte Korrektur der die Sichelzellen-Erkrankung verursachenden p.E6V-Mutation in Patienten-abgeleiteten HSPCs. Mark Behlke, MD, PhD, leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter bei IDT und Co-Autor der Studie, sagte: "Frühere Versuche zur Verbesserung der Cas9-Spezifität charakterisierten die Mutanten unter Verwendung von Plasmid-basierten Methoden, die zu einer anhaltenden Überexpression des Cas9-Proteins führen, die ansteigt Zielaktivität und ist nicht ideal für medizinische Anwendungen. Diese anhaltende Überexpression rettete jedoch die Funktion der Mutanten, die ansonsten eine geringe Aktivität aufwiesen, wenn sie im transienten RNP-Format verwendet wurden. Wir haben spezifisch einen breiten Screen durchgeführt, um eine Mutante zu identifizieren, die bei niedrigen Proteinkonzentrationen, die mit der RNP-Gabe erreicht werden, eine gute Leistung zeigt, die Sicherheit maximiert und unerwünschte Nebenwirkungen weiter reduziert. Prof. Porteus demonstrierte die Nützlichkeit unter Verwendung des neuen Systems, um die SCD-Mutation in normalen humanen blutbildenden Stammzellen zu korrigieren, während bekannte Aktivitäten außerhalb des Ziels minimiert wurden. Wir erwarten ein signifikantes Interesse an der Verwendung der neuen Cas9-Mutante in translationalen medizinischen Anwendungen